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PCR技術(shù):PCR污染及對(duì)策

更新時(shí)間:2025-05-30      點(diǎn)擊次數(shù):895

在PCR實(shí)驗(yàn)中,污染是一個(gè)常見(jiàn)且嚴(yán)重的問(wèn)題,可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。為有效預(yù)防和處理PCR污染,需遵循以下注意事項(xiàng):

一、實(shí)驗(yàn)分區(qū)與操作流程

合理劃分實(shí)驗(yàn)區(qū)域:將實(shí)驗(yàn)分為標(biāo)本處理區(qū)、PCR反應(yīng)液制備區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū),各區(qū)域應(yīng)有明確的隔離和方向性,避免交叉污染。

單向工作流程:從預(yù)PCR到后PCR,實(shí)行“單向"工作流程,確保在后PCR區(qū)域引入的耗材和防護(hù)裝備不會(huì)未經(jīng)消毒就回到預(yù)PCR區(qū)域。

試劑與樣品分離:PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存,不應(yīng)放于同一冰盒或冰箱。

二、試劑與材料準(zhǔn)備

試劑分裝:所有PCR試劑應(yīng)在超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝,使用專(zhuān)用加樣器和吸頭,避免交叉污染。

試劑儲(chǔ)存:實(shí)驗(yàn)室自配的試劑(如去離子水、緩沖液等)在使用前應(yīng)高壓滅菌或過(guò)濾除菌。

試劑小量分裝:PCR試劑應(yīng)小量分裝,以減少重復(fù)取樣次數(shù),并置于-20℃保存。

三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

正確佩戴防護(hù)裝備:實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套。

避免氣溶膠污染:操作時(shí)應(yīng)勤換手套,進(jìn)出不同區(qū)域或進(jìn)行模板操作后應(yīng)及時(shí)更換手套;開(kāi)管動(dòng)作要輕,以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠。

減少操作污染:在同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí),應(yīng)制備主反應(yīng)混合液,再分裝至PCR反應(yīng)管,最后添加樣品核酸模板,以減少單個(gè)添加操作繁瑣造成的污染。

使用防濺污染的吸頭:使用防濺污染的移液器吸頭,減少樣本或試劑中的氣溶膠形成

四、污染監(jiān)測(cè)與處理

設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn):設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照,監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況,選擇合適的對(duì)照樣品。

污染識(shí)別:使用“無(wú)模板對(duì)照"(NTC),其中NTC孔包含所有qPCR反應(yīng)組件,但不包含DNA模板。如果在NTC孔中觀察到擴(kuò)增,可能表明反應(yīng)組件中存在污染。

污染處理:若發(fā)生污染,應(yīng)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照監(jiān)測(cè)污染情況,排除試劑污染后,考慮環(huán)境污染的可能性,通過(guò)追蹤實(shí)驗(yàn)查找污染源,必要時(shí)更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所或重新設(shè)計(jì)引物。

五、實(shí)驗(yàn)室清潔與消毒

定期清潔:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)操作臺(tái)面、儀器、實(shí)驗(yàn)用具及環(huán)境進(jìn)行清潔,避免污染。

消毒措施:使用10-15%的漂白溶液(次氯酸鈉)擦拭表面,讓漂白劑作用于表面10至15分鐘后,用去離子水擦拭,最后用70%酒精浸濕的紙巾快速干燥表面。

設(shè)備消毒:定期消毒用于準(zhǔn)備qPCR反應(yīng)的表面和設(shè)備,包括工作臺(tái)面、移液器、冰箱/冷凍室把手、離心機(jī)、渦旋器和其他觸點(diǎn)。

六、污染控制技術(shù)

UNG法:使用尿嘧啶糖苷酶(UNG)去除PCR產(chǎn)物中的污染,優(yōu)點(diǎn)是能去除任何來(lái)源的污染,且UNG處理可與PCR擴(kuò)增在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行

DNase I法:采用DNase I法處理反應(yīng)液污染,適用于去除污染DNA。

固相捕獲法:利用生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交,再用包被鏈霉親和素的固相載體捕獲雜交核酸,從而去除污染

七、其他注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)記錄與驗(yàn)證:堅(jiān)持常規(guī)清潔工作,設(shè)計(jì)陰性對(duì)照組,連續(xù)三天陰性對(duì)照沒(méi)有起跳,則污染得到控制。

人員培訓(xùn):所有操作人員應(yīng)接受?chē)?yán)格培訓(xùn),確保操作規(guī)范,減少人為污染風(fēng)險(xiǎn)。

通過(guò)以上措施,可以有效預(yù)防和處理PCR污染,確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。


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