如何添加慢病毒量？確定靶細(xì)胞 MOI 值

不論是對活體還是體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，慢病毒表達(dá)載體對遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率至關(guān)重要。慢病毒最早起源于人免疫缺陷病毒 (HIV) 或貓免疫缺陷病毒（FIV），能夠感染幾乎所有類型的細(xì)胞，包括難以用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染甚至無法用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

許多客戶對如何用慢病毒顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)持有疑問，特別是對如何選擇適合的慢病毒量感到困惑。這個(gè)問題可根據(jù)確定細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection, MOI）來解決。

滴度與 MOI？

TU/mL 是目前使用廣泛的慢病毒顆粒滴度單位，「TU」為「Transduction Units」的縮寫，表示可成功轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞的基因組數(shù)。

選購慢病毒顆粒之前，首先需了解目的細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)：MOI。MOI 的概念很簡單，可有效感染細(xì)胞的慢病毒顆粒數(shù)與被感染細(xì)胞數(shù)的比值即為該細(xì)胞的 MOI 值。例如，應(yīng)用 106 TU 慢病毒感染 106 個(gè)細(xì)胞可成功使 80% 以上細(xì)胞達(dá)到轉(zhuǎn)導(dǎo)目的時(shí)，MOI=1；如需要以 5 × 106 TU 病毒才可成功感染 106 個(gè)細(xì)胞，則 MOI = 5。（TU/mL 為慢病毒滴度單位，TU 表示有活性的慢病毒量）

如何確定目的細(xì)胞的 MOI 值?

慢病毒對不同類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率各不相同，因此 MOI 也各異。在此，我們列出了多種常用細(xì)胞系的 MOI，助您選購合適的慢病毒量。下表是 GeneCopoeia 通過實(shí)驗(yàn)摸索得出的多種細(xì)胞系的 MOI 參考值。

請注意：上表所示的 MOI 值僅供您選購慢病毒時(shí)作為用量參考。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)、操作手法等的差別，實(shí)際數(shù)據(jù)可能有輕微浮動(dòng)。所以當(dāng)您收到所購買的慢病毒時(shí)，我們?nèi)匀唤ㄗh您通過設(shè)計(jì)梯度 MOI 感染小量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（如：MOI = 0.3, 1, 3, 5, 10, etc.）檢測目的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，確認(rèn)其 MOI 值。另外，若您的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞未被列在上表中，梯度實(shí)驗(yàn)確定最佳 MOI 是至關(guān)重要。您可將病毒進(jìn)行梯度稀釋，分別感染等量的細(xì)胞（見圖 1）。
 

圖 1. 梯度稀釋慢病毒顆粒，摸索細(xì)胞最佳 MOI 值

進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的 1 天前，于 96 孔板鋪板培養(yǎng)目的細(xì)胞 (實(shí)例中使用了 H1299 細(xì)胞)；在進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天，以 10 倍梯度稀釋慢病毒并分別進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)導(dǎo) 72 小時(shí)后以熒光顯微鏡觀察 GFP 報(bào)告基因表達(dá)情況，確定該細(xì)胞在最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效果下的慢病毒量。

最后，若您的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞要求較高的 MOI 值, 您還可通過以下幾種方法將其降低。方法一是加入 polybrene (hexadimethrine bromide), 一種能夠減少病毒與細(xì)胞膜間電荷排斥作用的陽離子聚合物。另一種方法是使用能夠捕獲慢病毒顆粒的磁珠（例如，利用磁珠可成功地將 MM-AN 細(xì)胞的 MOI 從 16 降到 4）。購買或構(gòu)建克隆時(shí)，可選擇載體骨架上帶有標(biāo)記基因（如：Puromycin, Neomycin 等）的克隆，可方便后續(xù)進(jìn)行藥物篩選，建立將目的基因成功地隨機(jī)整合到特定細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞株。

二、慢病毒感染目的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟

1. 感染預(yù)實(shí)驗(yàn)

以 24 孔培養(yǎng)板為例，同時(shí)進(jìn)行目的細(xì)胞和工具細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)。工具細(xì)胞可選擇 293T（人胚腎上皮細(xì)胞）、H1299（人肺癌細(xì)胞）或其它細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)材料：培養(yǎng)基、24 孔培養(yǎng)板，移液槍，槍頭， EP 管，細(xì)胞計(jì)數(shù)板、冰盒、廢液缸等。（根據(jù)目的細(xì)胞情況，可酌情使用 Polybrene）

Day1：
準(zhǔn)備細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，細(xì)胞以胰酶消化計(jì)數(shù)后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)測出細(xì)胞密度，每孔接種 5×104 個(gè)細(xì)胞，添加細(xì)胞培養(yǎng)液至 500µL。通常情況下，該接種量的 H1299 或 293T 細(xì)胞在感染后第 3 天可生長至 80%-90% 融合度。（接種目的細(xì)胞時(shí)，請根據(jù)細(xì)胞的實(shí)際生長速度調(diào)整接種量，使目的細(xì)胞感染后第 3 天生長至 80%-90% 融合度）

Day2：
（1）準(zhǔn)備慢病毒顆粒：計(jì)算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在 -80℃ 的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的細(xì)胞：從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及細(xì)胞融合度；如細(xì)胞狀態(tài)較好，則開始實(shí)驗(yàn)：
A. 用移液槍小心吸去 24 孔板中的舊培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液；
B. 在細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的慢病毒顆粒液，將培養(yǎng)板平置于工作臺(tái)上，以劃 8 字的方式輕柔混勻；
C. 混勻后，細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。

Day3：
更換培養(yǎng)液：感染 12-16 小時(shí)后，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，重新向培養(yǎng)板添加含 5% 滅活 FBS（胎牛血清）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（目的細(xì)胞需要調(diào)整感染時(shí)長，部分細(xì)胞不可感染超過 12 小時(shí)。）

Day4：
繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)是否有異常。

Day5：
觀察（評估）慢病毒顆粒感染效率：蓋緊 24 孔培養(yǎng)板，使用 70% 乙醇清理培養(yǎng)板外壁，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，拍照并估計(jì)慢病毒顆粒對細(xì)胞的感染效率。（如果慢病毒顆粒攜帶的基因表達(dá)所需的時(shí)間較長，熒光表達(dá)所需時(shí)間也較長，建議感染 72、96 小時(shí)后觀測熒光表達(dá)。）

根據(jù)熒光情況，可以初步從 MOI 梯度摸索實(shí)驗(yàn)中，找出適合目的細(xì)胞的 MOI 值。
 

圖 1. H1299 細(xì)胞的 MOI 梯度摸索結(jié)果示例
 

示例中使用的慢病毒顆粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×10 8TU/mL），曝光時(shí)間 1s，顯微倍數(shù) 100×。從上圖可見第 2 組細(xì)胞的感染效率已達(dá)到 90%。由于慢病毒顆粒對細(xì)胞有一定毒性，當(dāng) MOI 值過高時(shí)，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細(xì)胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。

熒光報(bào)告基因和目的基因的相對表達(dá)并不總是成等比關(guān)系的。在有的情況下，即使熒光報(bào)告基因表達(dá)較低或無表達(dá)，目的基因依然能夠表達(dá)；反之亦然。所以在觀察熒光效果后，建議使用 qRT-PCR 作進(jìn)一步鑒定。
 

圖 2. 293T 細(xì)胞的 MOI 梯度摸索結(jié)果示例
 

示例中使用的慢病毒顆粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×108TU/mL），曝光時(shí)間 0.6s，顯微倍數(shù) 100×。從上圖可見第 2 組細(xì)胞的感染效率已達(dá)到 80%。由于慢病毒顆粒對細(xì)胞有一定毒性，當(dāng) MOI 值過高時(shí)，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細(xì)胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。

2. 摸索細(xì)胞的最適藥物篩選濃度

細(xì)胞的種類與狀態(tài)均會(huì)影響慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，部分細(xì)胞可能與慢病毒顆粒有相互抵抗的現(xiàn)象，導(dǎo)致感染效率低。當(dāng)您在感染后 72、96 小時(shí)后發(fā)現(xiàn)感染效果仍不理想，建議對感染后的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選（藥篩），以收集較多感染成功的細(xì)胞。

慢病毒顆粒攜帶的基因整合到目的細(xì)胞基因組是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，當(dāng)抗性基因表達(dá)時(shí)，目的基因不一定也能表達(dá)，在進(jìn)行藥篩處理后，還要以 qRT-PCR 作進(jìn)一步鑒定。

在進(jìn)行正式的抗生素篩選前，建議您先對空白細(xì)胞的最小致死濃度進(jìn)行摸索、優(yōu)化。
 

表 4. 抗生素篩選細(xì)胞的相關(guān)參考值

以 293T 細(xì)胞+Puromycin 為例，從相關(guān)文獻(xiàn)查得 Puromycin 對 293T 細(xì)胞的最小致死濃度為 2 µg/mL。在 2 µg/mL 附件多設(shè)置幾個(gè)濃度梯度，可以得出較精確的的篩選濃度。

（1）準(zhǔn)備 24 孔培養(yǎng)板，按每孔 1-5×104 細(xì)胞數(shù) (約等于 20%-35% 融合度) 接種 293T 空白細(xì)胞，對其中 6 個(gè)孔進(jìn)行鋪板；

（2）一般 Puromycin 母液的濃度是 10 mg/mL，用細(xì)胞培養(yǎng)基將 Puromycin 母液稀釋 1000 倍，可獲得終濃度為 10 µg/mL 的 Puromycin 稀釋液；

（3）按表 5 所示，每孔添加相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基和 Puromycin；

（4）24 孔培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過夜；

（5）按表 4 的藥篩時(shí)間和觀察時(shí)間建議，定期在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。
當(dāng)空白細(xì)胞剛好能全部死亡時(shí)，該濃度的抗生素可作為最適藥篩濃度。
 

表 5. 藥物篩選濃度梯度參考（Puromycin）

 

* 表格中使用的 Puromycin 濃度為 10 µg/mL，是由 10 mg/mL 的 Puromycin 母液以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋 1000 倍所得。

注：以上表格的設(shè)置僅供參考。通常即使細(xì)胞一樣，由于培養(yǎng)的條件和傳代次數(shù)不一樣，篩選濃度亦不一樣。可根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行更進(jìn)一步的細(xì)化濃度梯度設(shè)置。 如果藥篩過程中細(xì)胞量較少，為保持細(xì)胞的數(shù)一定，一般不換液，只有在穩(wěn)轉(zhuǎn)株藥篩過程中，根據(jù)細(xì)胞生長速度，3-4 天換液一次。

如果目的細(xì)胞較難感染，一次感染不能達(dá)到預(yù)期效果時(shí)，在感染 3 天后可對目的細(xì)胞進(jìn)行藥篩處理，獲得較多被感染的細(xì)胞，如以下例子所示：
 

圖 3. 人食管癌細(xì)胞 CE-81T（貼壁細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
 

圖 4. 人骨肉瘤細(xì)胞 Hos（貼壁細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
 

圖 5. 人白血病 K562（懸浮細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
 

圖 6. 293T 細(xì)胞在不同融合度的明視野效果（放大倍數(shù)：100×）

3. 實(shí)驗(yàn)體系的放大和正式實(shí)驗(yàn)；

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，放大慢病毒顆粒細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，實(shí)施正式實(shí)驗(yàn)。

通過慢病毒顆粒感染細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們大致獲得慢病毒顆粒感染目的細(xì)胞的優(yōu)化條件。正式實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞數(shù)往往比預(yù)實(shí)驗(yàn)多，慢病毒顆粒用量也需要適當(dāng)放大。放大原則是保持細(xì)胞密度一致，按實(shí)際細(xì)胞數(shù)與預(yù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)的比例放大培養(yǎng)液體積和慢病毒顆粒用量。有兩種放大方法可供參考：

按底面積放大（適用于貼壁細(xì)胞）
當(dāng)細(xì)胞的密度不變時(shí)，細(xì)胞總數(shù)和底面積成正比，且 MOI 不變，所需慢病毒顆粒用量也和底面積成正比。假設(shè)預(yù)實(shí)驗(yàn)使用 96 孔板（底面積 0.3 cm2），使用 1 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染細(xì)胞；如正式實(shí)驗(yàn)使用 6 孔板（底面積 10 cm2），則：
底面積的放大倍數(shù) ≈ 33
正式的慢病毒顆粒用量 = 預(yù)實(shí)驗(yàn)用量×33 = 33 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：請確保細(xì)胞均勻、單層分布，不成簇生長。

按培養(yǎng)體積放大（適用于懸浮細(xì)胞）
當(dāng)細(xì)胞的密度不變時(shí)，細(xì)胞總數(shù)和感染體積成正比，且 MOI 不變，所需慢病毒顆粒用量也和培養(yǎng)液體積成正比。假設(shè)預(yù)實(shí)驗(yàn)使用 96 孔板（培養(yǎng)體積 100μL），使用 1 μL 慢病毒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染細(xì)胞；如正式實(shí)驗(yàn)使用 6 孔板（培養(yǎng)體積 2 mL），則：
培養(yǎng)體積的放大倍數(shù) = 20
正式的慢病毒顆粒用量 = 預(yù)實(shí)驗(yàn)用量×20 = 20 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：請確保細(xì)胞生長狀態(tài)良好。

三、使用慢病毒的常見問題

1. 怎樣購買份量合適數(shù)量的慢病毒顆粒？

一套完整實(shí)驗(yàn)所需的慢病毒顆粒包括：1. 含有目的基因的慢病毒顆粒，2. 陰性對照慢病毒顆粒，3. 用于預(yù)實(shí)驗(yàn)的陽性對照慢病毒顆粒。

購買時(shí)可以根據(jù)目的細(xì)胞特性、檢測方法、培養(yǎng)器皿估算慢病毒顆粒的最佳用量，避免剩余的大量慢病毒顆粒超出最佳保存期；此外，GeneCopoeiaTM 同時(shí)提供高滴度低價(jià)格的陽性對照慢病毒顆粒，幫助您以較低的預(yù)算和較充足的材料完成預(yù)實(shí)驗(yàn)的條件探索。初次使用慢病毒顆粒的研究者也可使用陽性對照慢病毒顆粒熟悉實(shí)驗(yàn)過程。

2. 慢病毒顆?？梢杂糜趧?dòng)物體內(nèi)（In vivo）實(shí)驗(yàn)嗎？

GeneCopoeiaTM 提供的即用型慢病毒顆粒全部經(jīng)過純化、濃縮處理，去除了細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，進(jìn)一步降低免疫原性，適用于各類活體動(dòng)物注射實(shí)驗(yàn)和成瘤實(shí)驗(yàn)。

3. 慢病毒顆粒對目的細(xì)胞的感染效率很低，如何提高感染效率？

提高感染效率的前提是保證細(xì)胞生長狀態(tài)良好。其次，可以通過提高 MOI 值來提高感染效率，也可以在培養(yǎng)基中加入 Polybrene (4-10 µg/mL) 提高感染效率。

4. 添加慢病毒顆粒后，細(xì)胞為什么大量死亡?

慢病毒顆粒對靶細(xì)胞有一定毒性。添加量過多、感染時(shí)間過長都可能對目的細(xì)胞 造成傷害。如遇上這種情況，建議您降低 MOI 值，并在感染細(xì)胞 4-8 小時(shí)后進(jìn)行換 液（以新鮮的全培養(yǎng)基替換含慢病毒顆粒的舊培養(yǎng)基），最長換液時(shí)間不可大于 12 小時(shí)。

5.Polybrene 是什么？在慢病毒顆粒感染中，Polybrene 添加越多越好嗎？

Polybrene 是常用的感染添加劑，通常的使用濃度為 4-10 µg/mL，Polybrene 能 顯著提高慢病毒的感染效率，通常能提高感染效率 2-10 倍，對部分細(xì)胞甚至可 提高感染效率 10-20 倍。當(dāng)目的細(xì)胞 MOI 高于 20 時(shí)，我們建議在培養(yǎng)基中加入 Ploybrene(約 4-10 µg/mL) 適當(dāng)提高感染效率。

然而，Polybrene 有一定的細(xì)胞毒性，不同細(xì)胞對 Polybrene 的敏感度和耐受性不同，部分細(xì)胞對 Polybrene 反應(yīng)明顯，容易導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差、形態(tài)發(fā)生變化、甚至死亡，因此并非每種細(xì)胞都適合添加 Polybrene。

在正式使用 Polybrene 前，建議在 1-10 µg/mL 范圍內(nèi)設(shè)置梯度，觀察細(xì)胞在該濃度下，24 小時(shí)后是否仍保持健康生長，從而確定該細(xì)胞的最適 Polybrene 濃度。

6. 目的細(xì)胞可以被慢病毒顆粒感染，但 eGFP 的熒光強(qiáng)度很低，為什么？

在目的細(xì)胞被慢病毒顆粒感染過程中，eGFP 熒光強(qiáng)度取決于病毒感染細(xì)胞內(nèi)的慢病毒顆粒數(shù)、細(xì)胞本身的狀態(tài)、細(xì)胞類型以及觀察時(shí)間等。一般情況下，目的細(xì)胞感染慢病毒顆粒數(shù)越多，細(xì)胞增殖越快，eGFP 熒光會(huì)較強(qiáng)。慢病毒攜帶基因表達(dá)時(shí)間較長，一般在增殖較快的細(xì)胞中也需要感染 72-96 小時(shí)才會(huì)到達(dá) eGFP 的表達(dá)高峰。對于增殖較慢的細(xì)胞，感染時(shí)間則需更長。建議如果您的細(xì)胞在感染后觀察的熒光強(qiáng)度較低，建議繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間再觀察。

7. 進(jìn)行慢病毒顆粒感染后，為什么目的細(xì)胞用 qPCR 檢測不到目的基因表達(dá)量的變化？

如果使用的檢測方法是 qPCR，原因可能是目的基因含特殊序列結(jié)構(gòu)、或與目的細(xì)胞系統(tǒng)不能兼容的問題，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受影響，建議同時(shí)培養(yǎng)、感染目的細(xì)胞和 293T 工具細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行檢測，如目的基因在 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄不受影響，則可能為目的基因與目的細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受阻。

8. 慢病毒顆粒在儲(chǔ)存期間不慎染菌，還可以繼續(xù)使用嗎？

如慢病毒顆粒不慎染菌，且實(shí)驗(yàn)材料有限，可以使用 0.45 µm 濾膜對慢病毒進(jìn)行濾菌操作。當(dāng)然，該操作會(huì)導(dǎo)致一定程度的滴度損失及慢病毒顆粒總量損失。如條件允許，建議重新購買該種慢病毒。